最近审查员发出一OA，指出“本申请涉及一种斑马鱼胚胎错配修复功能活性的分析方法及其应用，经审查，现提出如下审查意见：
权利要求1-10请求保护的技术方案不具有实用性，不符合专利法第22条第4款的规定。 权利要求1-10中请求保护的技术方案中包含的将同源和异源双链核酸分子分别显微注射至1-细胞期的斑马鱼胚胎中属于对动物实施非治疗目的的外科手术方法，无法在产业上使用，因此，不具备专利法第22条第4款规定的实用性。”
以下是该专利的权利要求“1.一种斑马鱼胚胎DNA 错配修复功能活性的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括以下步骤：
1）以质粒pGEM-EGFP制备单链DNA 分子，所述质粒pGEM-EGFP能正常表达绿色荧光蛋白；
2）用步骤1）中获取的单链DNA 分子同线性化的质粒pGEM-EGFP以及pGEM-（mt）EGFP分别制备同源和异源双链核酸分子，其中所述质粒pGEM-（mt）EGFP的绿色荧光蛋白基因内第58个三联密码子处存在一无义突变，不能正常表达绿色荧光蛋白；
3） 将制备好的同源和异源双链核酸分子分别显微注射至1-细胞期的斑马鱼胚胎中；
4） 对胚胎DNA 错配修复功能活性进行定量。
2. 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤1）包括：以转化质粒pGEM-EGFP的大肠杆菌为材料，使用辅助噬菌体M13KO7，通过侵染的方法获取单链DNA 分子。
3. 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述步骤1）包括：以质粒pGEM-EGFP为材料，使用缺刻酶Nb.BsrdⅠ或Nb.Bpu10Ⅰ形成带缺刻的开环质粒，然后使用核酸外切酶Ⅲ进行消化反应获得单链DNA 分子。
4. 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤2）包括：将单链DNA 分子同经限制性内切酶BstXⅠ或MluⅠ线性化的质粒pGEM-EGFP以及pGEM-（mt）EGFP分别进行退火，退火后产物经质粒安全性酶PSAD消化，去除残留的单链DNA 分子和线性化的质粒即可获得高纯的同源和异源双链核酸分子。
5. 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤2）中所述质粒pGEM-EGFP以及pGEM-（mt）EGFP在碱基组成上只有一个碱基的差别。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤2）中所述异源双链核酸分子中EGFP基因内第58个三联密码子处存在一G/T错配。
7. 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤3）包括：对胚胎分别注射30~100ng/μL的同、异源双链核酸分子，且同、异源双链核酸分子注射量相等，注射部位为细胞质或卵黄囊，每枚胚胎为500pL，指示剂酚红浓度控制在0.025-0.050%，每个品系同源组和异源组注射同等数量的胚胎：≥100枚。
8. 根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤4）包括：注射胚胎12-36h后观察并拍照，用软件分析胚胎绿色荧光表达强度，并统计所注射胚胎绿色荧光表达率，胚胎DNA 错配修复功能活性以该品系的相对绿色荧光蛋白表达率来表示；所述相对绿色荧光蛋白表达率按以下公式计算获得：
相对绿色荧光蛋白表达率= 异源组荧光表达率×异源组平均荧光强度/同源组荧光表达率×同源组平均荧光强度。
9. 根据权利要求1-8中任一所述的分析方法，其特征在于，所述质粒pGEM-EGFP是通过将CMV-EGFP-PolyA片段从质粒pEGFP-N1酶切下来，然后利用T4连接酶连入载体pGEM5Zf(+)中而获得。
10. 权利要求1所述的分析方法在环境化合物DNA 错配修复功能毒性评价中的应用。”
不知各位高手有什么好的修改或答复方法，可以克服审查员指出的缺陷或说服审查员？多谢！！！ |
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